二抗的選擇和定位

　　第一步：選擇抗體。

　　三種二抗抗體：Whole IgG，F(xiàn)(ab&;rsquo;)2片段，F(xiàn)ab片段。

　　Whole IgG抗體適用于多數(shù)情況，是性?xún)r(jià)比最高的。Whole IgG是完整的抗體分子，有一個(gè)Fc部分和兩個(gè)與抗原結(jié)合的Fab部分 (Figure 1, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc網(wǎng)站)。

　　F(ab&;rsquo;)2片段抗體是胃蛋白酶消化IgG除去Fc部分，剩下靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的兩個(gè)Fab部分。F(ab&;rsquo;)2片段抗體用在避免抗體與Protain A 或G結(jié)合，或者與有Fc受體的活細(xì)胞結(jié)合。如果一抗是完整的抗體分子，不管二抗是哪種形式都可能結(jié)合Fc受體。

　　Fab片段抗體是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。這些抗體只含有一個(gè)Fab結(jié)合位點(diǎn)。它們用來(lái)封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來(lái)源的一抗多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中封閉暴露的免疫球蛋白。

　　第二步：一抗的物種來(lái)源。

　　為了正確的選擇二抗，必須知道一抗的物種來(lái)源。如果一抗是小鼠來(lái)源的，就找&;ldquo;anti-mouse&;rdquo;。

　　第三步：選擇二抗的物種來(lái)源。

　　第四步：選擇二抗的特異性。

　　因?yàn)椴煌�物種來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非事先特殊處理過(guò)(如標(biāo)有&;ldquo;min X Hu, Bov&;hellip;Sr Prot&;rdquo; - minimal cross-reactivity to human and bovine serum proteins) ), 經(jīng)過(guò)用圓括號(hào)中的物種 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附處理來(lái)降低交叉反應(yīng))。在選擇二抗時(shí)，只有在來(lái)自?xún)蓚�(gè)很相近的物種的一抗都存在而需要檢測(cè)其中一種時(shí)，才使用針對(duì)其中一種特殊吸附處理過(guò)的抗體。這樣的抗體可能不能和所有亞型的IgG都很好的反應(yīng)。比如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，使用針對(duì)大鼠吸附處理過(guò)的anti-mouse IgG來(lái)檢測(cè)小鼠的一抗，或者在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用了大鼠的一抗時(shí)。當(dāng)不含有大鼠免疫球蛋白時(shí)，最好采用沒(méi)有針對(duì)大鼠IgG處理過(guò)的anti-mouse二抗來(lái)檢測(cè)小鼠的一抗。牛血清白蛋白(BSA)和奶粉中可能含有牛IgG。直接針對(duì)牛，山羊，馬和綿羊的二抗會(huì)跟牛IgG反應(yīng)。因此，使用BSA或者奶粉來(lái)封閉或者稀釋這些抗體可能導(dǎo)致背景染色明顯增加，以及抗體效價(jià)的降低。這時(shí)，推薦使用5%的二抗來(lái)源物種的正常血清來(lái)封閉。

　　Anti-IgG (H+L)這類(lèi)抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈[比如Fc和F(ab&;rsquo;)2/Fab部分]都可以反應(yīng)。也可以和其他的免疫球蛋白家族(比如IgM和IgA)反應(yīng)，因?yàn)樗�有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(&;kappa;鏈或者&;lambda;鏈)。Anti-IgG (H+L) 比只抗片段的抗體識(shí)別更多的抗原表位。

　　Anti-IgG，F(xiàn)c fragment specific這類(lèi)抗體和IgG重鏈的Fc部分反應(yīng)。它們通過(guò)了ELISA檢測(cè)，和(或)針對(duì)Fab片段吸附的測(cè)試。某些情況下，需要額外檢測(cè)和處理來(lái)降低和IgM或IgA的交叉反應(yīng)，會(huì)被描述為&;ldquo;Anti-IgG, Fc&;gamma;fragment specific&;rdquo;。注意：不是所有anti-IgG, Fc抗體和所有亞型的IgG反應(yīng)能力一致。要找和四種IgG亞類(lèi)反應(yīng)能力差不多的anti-mouse IgG, Fc&;gamma;抗體的話(huà)，應(yīng)當(dāng)選Goat Anti-Mouse IgG (subclasses 1+2a+2b+3), Fc&;gamma;fragment specific (min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)。

　　Anti-IgG，F(xiàn)c&;gamma; Subclass specific抗體分別和不同的小鼠IgG亞型重鏈的Fc部分反應(yīng)。這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)ELISA和/或針對(duì)Fab片段、IgM和其他小鼠IgG亞型的吸附測(cè)試。

　　Anti-IgG，F(xiàn)(ab&;rsquo;)2 fragment specific和IgG的F(ab&;rsquo;)2/Fab部分反應(yīng)。這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)了ELISA和/或Fc片段的吸附檢測(cè)。因?yàn)楹洼p鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白反應(yīng)(如IgM和IgA)。

　　(min X&;hellip;Sr Prot)這類(lèi)抗體經(jīng)過(guò)了檢測(cè)，以及針對(duì)IgG和圓括號(hào)中的物種的血清蛋白的吸附處理。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時(shí)，推薦使用這類(lèi)抗體。但是，當(dāng)要選擇經(jīng)過(guò)針對(duì)相近物種吸附處理的抗體時(shí)，要特別注意，因?yàn)樗鼈兡茏R(shí)別的表位數(shù)量大大減小了，可能識(shí)別單抗的能力很弱。這種情況的例子有Anti-Mouse IgG (min X Rat,&;hellip;.Sr Prot), Anti-Rat IgG (min X Mouse, &;hellip;Sr Prot), 和 Anti-Ramenian Hamster IgG (min X Mouse, Rat, &;hellip;Sr Prot)。

　　ML (Multiple Labeling多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)): 有些抗體標(biāo)明了ML，來(lái)強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo)，還可用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

　　第五步：選擇需要的探針。

　　第六步：選擇的抗體的規(guī)格、價(jià)錢(qián)和目錄號(hào)。