臨床生物化學光譜分析技術的研究

　　利用各種化學物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，來確定其性質(zhì)、結構或含量的技術，稱為光譜分析技術。根據(jù)光譜譜系的特征不同，可把光譜分析技術分為發(fā)射光譜分析、吸收光譜分析和散射光譜分析三大類。在臨床生物化學檢驗中，光譜分析是一類十分重要的技術，應用極為廣泛。

　　I.光譜分析法(photometry)

　　1.定義：根據(jù)物質(zhì)吸收、發(fā)射或散射輻射能而建立起來的一類分析方法。

　　2.光的基本性質(zhì)：高速傳播的電磁輻射;

　　具有波動性(l=c/v)和微粒性(E=hv);短波能量大，長波能量小

　　3.物質(zhì)對光吸收的基本原理：

　　能量轉(zhuǎn)移----當光輻射通過某種物質(zhì)時，組成該物質(zhì)的分子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉(zhuǎn)移至分子、原子上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。

　　選擇吸收----組成物質(zhì)的分子僅吸收與其內(nèi)能變化(基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量差)相對應的波長或頻率的光，所得到的光譜稱為吸收光譜。

　　能量釋放----處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當其返回基態(tài)時，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應光譜，稱分子發(fā)射光譜。

　　4.分類

　　(1)吸收光譜分析法：根據(jù)溶液能吸收由光源發(fā)出的某些波長的光后所形成的特征光譜來鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)和含量的方法。

　　(可見、紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry)原子吸收光譜法(atomicabsorptionspectrophotometry)：微量金屬元素紅外分光光度法)

　　(2)發(fā)射光譜分析法：根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來進行定性及定量分析的一種方法。

　　(火焰發(fā)射光譜法(flameemissionphotometry)：堿金屬/堿土金屬元素熒光光譜法(fluorometry)：少量無機物、酶活力、激素等)

　　(3)比濁/散射光譜分析法：測定光線通過溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類定量方法。

　　比濁法(turbidimetry)：在光源的光路方向上測定透射光強度(透射光&散射光)與入射光強度的比值和膠體溶液中質(zhì)點濃度間的關系。

　　散射測濁法(nephelometry)：在光路的垂直方向上測量散射光強度和膠體溶液中質(zhì)點間的關系。

　　5.特點：靈敏度高;測定簡便、快速;試樣不被破壞等。

　　II.可見、紫外分光光度法

　　1.定義：根據(jù)物質(zhì)分子對于200nm~700nm光區(qū)電磁輻射的吸收特性進行分析的方法。

　　可見光：400~700nm,有色物質(zhì)溶液

　　紫外光：200~400nm,無色物質(zhì)

　　2.特點：靈敏度高(10-4~10-7g/ml);選擇性強;精確度和準確度高;儀器設備簡單，操作易掌握

　　3.吸收光譜

　　(1)光譜的產(chǎn)生：化合物分子的價電子躍遷

　　(2)吸收光譜曲線：電子躍遷的吸收波長和吸收強度可用儀器測定，在可見、紫外光區(qū)內(nèi)繪制或掃描得到一條以波長(l)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標的吸收曲線。

　　4.光吸收的基本定律(Lamber-Beer’sLaw)

　　(1)定律：單色光通過吸光溶液后，吸光度與濃度或厚度之間呈正比關系。

　　Lamber定律：說明吸收與厚度間的關系

　　Beer定律：說明吸收與濃度間的關系

　　(2)表達式：

　　*a為吸光系數(shù)(absorptivity),即吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。

　　b為液層厚度

　　c為溶液濃度(concentration)

　　5.比色法(colorimetry)

　　(1)定義：用可見光作光源，比較溶液的顏色深淺度以測定所含有色物質(zhì)濃度的方法

　　(2)所用儀器：分光光度計(spectrophotometer)

　　(i)基本原理：溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收的效應，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，故當某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關系。

　　(ii)結構組成(以722分光光度計為例)

　　光源：可見光區(qū)的光源為鎢燈，波長范圍是320~1000nm。

　　(紫外光區(qū)的光源為氫燈或氘燈，波長是200~320nm)

　　單色器：一種將光源產(chǎn)生的混合光分解為單一波長的光學系統(tǒng)。一般是根據(jù)通過棱鏡的折射或光柵的衍射而獲得的。

　　試樣室：由比色皿座架及光門組成。可見光區(qū)用光學玻璃比色皿(紫外光區(qū)用石英比色皿)

　　光電管暗盒：由光電管(可將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢苑糯髾z測和記錄的電能)和微電流放大器組成。

　　顯示器：由放大器和讀數(shù)元件組成。

　　(3)比色法的定量方法：

　　(i)標準曲線法：將一系列濃度不同的標準溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸光度(A)，以A為縱坐標，濃度為橫坐標制標準曲線(至少要5點)。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標準曲線找出相對應的濃度。

　　(ii)對比法：將標準品與待測樣品在相同條件下顯色并測定各自的吸光度。由于測定體系溫度、厚度及入射光波長一致，故標準與待測樣品a&b值相等，可用下式比較計算待測樣品濃度Cx=Cs´As/Ax。