干細(xì)胞的原代提取

　　胚胎干細(xì)胞

　　免疫學(xué)法是較為常用的分離方法，它可選擇性地殺死囊胚外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞，而僅保留ICM。它的原理是先將胚泡與抗小鼠的血清共同孵化一段時(shí)間后，然后加入補(bǔ)體，在補(bǔ)體的作用下，外層的滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生溶解，而ICM則不受影響。

　　神經(jīng)干細(xì)胞

　　目前，神經(jīng)干細(xì)胞的分離方法主要有三種：無(wú)血清培養(yǎng)基自然篩選法、流式細(xì)胞術(shù)分選法、免疫磁珠分選法。

　　無(wú)血清培養(yǎng)基自然篩選法是迄今應(yīng)用最為廣泛，也是最簡(jiǎn)單和容易操作且行之有效的方法。其原理是利用特殊的培養(yǎng)基使成熟的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法較長(zhǎng)時(shí)間地成活，而分離篩選出能夠在該培養(yǎng)條件下存活并繁殖的神經(jīng)干細(xì)胞群體。

　　步驟： (1)取胎腦;

　　(2)用吸管吹吸使細(xì)胞分散均勻;

　　(3)加小鼠神經(jīng)干完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

　　脂肪間質(zhì)干細(xì)胞

　　分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞主要是通過(guò)膠原酶進(jìn)行消化，獲得細(xì)胞懸液。分離培養(yǎng)大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞的大致步驟如下：

　　(1)取腹股溝處脂肪，充分剪碎;

　　(2)加入膠原酶，將其轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行消化30分鐘，加入培養(yǎng)基終止消化;

　　(3)離心，大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種至培養(yǎng)瓶中。

　　骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

　　目前常用的分離MSC的方法有密度梯度離心法和全骨髓貼壁法。全骨髓貼壁法的原理是根據(jù)間質(zhì)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢(shì)特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化與擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的。

　　步驟 : (1)取大鼠股骨和脛骨，以完全培養(yǎng)基沖洗股骨和脛骨骨髓，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，去上清;

　　(2)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種培養(yǎng);

　　(3)原代培養(yǎng)36h全液量換液，去除未貼壁的造血細(xì)胞，以后每3天換液一次，直到細(xì)胞80-90融合傳代。