檢測蛋白磷酸化的方法

　　蛋白激酶將磷酸基團從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白多肽底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，直接影響目標的活性和功能。放射性研究表明，真核細胞中大約30%的蛋白經(jīng)過磷酸化修飾。這一關(guān)鍵的翻譯后修飾調(diào)控了廣泛的細胞活性，包括細胞周期、分化、代謝和神經(jīng)元通訊。此外，異常的磷酸化事件與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。在評估磷酸化時，選擇的方法可能會有所不同，這取決于多個因素，包括提出的具體問題以及特殊儀器或試劑的可用性。如何檢測蛋白磷酸化，本文簡要介紹了幾種常用方法，并提出了每種方法的優(yōu)點和缺點。

　　激酶活性分析

　　蛋白激酶通常是多個信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了眾多負責生物反應的下游效應物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統(tǒng)來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產(chǎn)生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關(guān)特定激酶行為的信息，但評估細胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號通路的冰山一角。我們對蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測可能為細胞如何應對外界刺激提供更詳細的分析，因為磷酸化肽段的鑒定為蛋白的表達和功能狀態(tài)提供信息。

　　磷酸化特異抗體的開發(fā)

　　直接測定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典方法是將整個細胞與放射性標記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細胞提取物，通過SDS-PAGE分離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統(tǒng)方法包括2D凝膠電泳，這種技術(shù)假定磷酸化會改變蛋白的遷移率和等電點。

　　鑒于這些方法很費力，磷酸化依賴抗體的開發(fā)受到研究人員的極大歡迎。1981年，第一個有記錄的磷酸化抗體在兔子中產(chǎn)生，使用的是鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸結(jié)合物。這一抗體廣泛地識別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發(fā)出多個磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進以及新的免疫分析技術(shù)的開發(fā)打開了大門。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體的忠告是，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。

　　Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法，大部分細胞生物學實驗室都擁有開展這些實驗的設(shè)備。利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨后轉(zhuǎn)移到膜上(通常是PVDF或尼龍膜)，之后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Western blot實驗步驟避免了使用放射性同位素時的危險品和廢物處理要求。許多磷酸化特異抗體十分靈敏，可輕松檢測常規(guī)樣品(如10-30 µg細胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個抗體來檢測同源蛋白的總水平(而不考慮磷酸化狀態(tài))，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并充當上樣內(nèi)對照�；瘜W發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。

　　酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)

　　ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調(diào)節(jié)激酶活性和功能的研究中表現(xiàn)出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質(zhì)樣品(如細胞裂解液)中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設(shè)計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強度與最初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術(shù)具有一些優(yōu)點。首先，利用經(jīng)過校準的標準品，可輕松定量結(jié)果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個抗體，帶來了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。最后，微孔板形式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來了激酶活性的間接測定。不過，另一類ELISA技術(shù)使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來激酶活性的更直接測定。