細(xì)胞培養(yǎng)法闡述

　　二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序?yàn)椋?

　　1.吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中。

　　2.用溫BSS沖洗1次。

　　3.用0.25%溫胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋細(xì)胞層即可;作用1~5分鐘。

　　4.待細(xì)胞附著松動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化。為防止細(xì)胞丟失，可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養(yǎng)液(新舊培養(yǎng)液按2：1新舊混合)。

　　5.輕輕反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

　　6.按一分為二比例接種培養(yǎng)。

　　2)支持物培養(yǎng)法加支持物培養(yǎng)法與一般培養(yǎng)法相同，只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。

　　1.支持物制備：如用特氟隆薄膜，無(wú)菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養(yǎng)接種細(xì)胞前，先置入培養(yǎng)容器中即可;通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養(yǎng)瓶中，然后按如下順序處理：自來(lái)水浸泡24小時(shí)—96%酒精30～60min—蒸餾水浸泡 30～60min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養(yǎng)皿中—高壓或干熱滅菌備用。

　　2.培養(yǎng)法：初代消化培養(yǎng)、初代組織塊培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等皆可應(yīng)用加支持物培養(yǎng)法。接種細(xì)胞后，可在任何時(shí)間取出支持物，做各種觀察或?qū)嶒?yàn)。3)細(xì)胞分離(克隆)培養(yǎng)多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法：1.消化：取健康待克隆細(xì)胞，吸出瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加消化液。

　　3.低密度細(xì)胞懸液的制備：做克隆細(xì)胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后稀釋細(xì)胞，使之成為1~2細(xì)胞/毫升懸液，最適宜細(xì)胞密度為1~2細(xì)胞/ml培養(yǎng)液。

　　4.接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在最短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)。

　　5.標(biāo)記：培養(yǎng)6~12小時(shí)后，待細(xì)胞下沉冰貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含有單個(gè)細(xì)胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)中一般無(wú)需換液，只有在細(xì)胞增長(zhǎng)過(guò)于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過(guò)多，余少許，以免細(xì)胞干涸。然后再迅速補(bǔ)加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4周。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500~600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行分離培養(yǎng)。

　　6.分離擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)86~96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2次，繼加胰蛋白酶少許，加入量已能覆蓋細(xì)胞群即可，如過(guò)多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)，加入0.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補(bǔ)加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增殖，使之形成新的細(xì)胞群后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。必須保證分離出來(lái)的細(xì)胞確為一個(gè)而不是兩個(gè)或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功，為此常采取以下一些措施：使用適應(yīng)性培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基(ConditionalMedium)。

　　細(xì)胞培養(yǎng)制備方法：

　　1.培養(yǎng)同源細(xì)胞(未克隆前時(shí)的同一細(xì)胞)至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液。

　　2.離心：3000~4000/分離心10分鐘，吸取上清液。

　　3.濾過(guò)：再經(jīng)直徑0.22μm濾孔的濾膜過(guò)濾，低溫凍存貯備用;用時(shí)取1分適應(yīng)培養(yǎng)基+2分培養(yǎng)基混合使用。使用飼細(xì)胞(FeederCells)。

　　4)球體細(xì)胞培養(yǎng)瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無(wú)菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5ml2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好已連接成片的細(xì)胞，用彎頭吸管伸入瓶?jī)?nèi)，把細(xì)胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細(xì)胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5ml，用吸管把已松動(dòng)的細(xì)胞片吸打下來(lái)，分裝入1~3個(gè)含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長(zhǎng)成細(xì)胞球體。換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細(xì)胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)充新培養(yǎng)液。

　　5)微載體細(xì)胞培養(yǎng)法

　　1.微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的吸著率和計(jì)算細(xì)胞數(shù)，以得到最大量細(xì)胞為佳。

　　2.水化：稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)，室溫下放置應(yīng)不少于3小時(shí)，并不時(shí)輕微攪動(dòng)，然后再用新鮮PBS洗一次。

　　3.消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70%酒精浸泡消毒，再用無(wú)菌的PBS漂洗一二次。

　　4.傳代培養(yǎng)：在連續(xù)進(jìn)行微載體培養(yǎng)時(shí)，可以不必把細(xì)胞從微載體分離下來(lái)，可將帶有細(xì)胞的微載體和新的微載體混合進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞能移動(dòng)到新載體上。如果進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)或需要分離細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，和常規(guī)培養(yǎng)相同，先用EDTA+胰蛋白酶溶液作用使細(xì)胞脫離微載體表面。細(xì)胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細(xì)胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細(xì)胞。如果需要分離程度較高時(shí)，需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后，再離心濾過(guò)液，就可得到較純凈的細(xì)胞。

　　6)懸浮培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)是使帖壁細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如所需培養(yǎng)的細(xì)胞本身屬懸浮生長(zhǎng)型，則無(wú)須做任何處理;在傳代時(shí)先做離心處理去除舊培養(yǎng)液，添加新培養(yǎng)液即可。但在培養(yǎng)帖附型細(xì)胞時(shí)，必須進(jìn)行干擾細(xì)胞不能帖附