避免RNA酶污染的方法

　　RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后又迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的RNase完全失活。為了獲得高質(zhì)量的真核細(xì)胞mRNA，必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法，最大限度地降低細(xì)胞破碎過(guò)程中所釋放的RNA酶的活性。同時(shí)，避免偶然引入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶污染問(wèn)題的一些注意事項(xiàng)。大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的研究者并不拘泥于這些注意事項(xiàng)，只是在遇到問(wèn)題時(shí)可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。我們謹(jǐn)將下述內(nèi)容作為解決RNA酶污染問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)指南。 

　　1．塑料制品：盡可能使用無(wú)菌、一次性塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒(méi)有開封使用過(guò)，通常沒(méi)有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，有些廠家提供的產(chǎn)品已達(dá)到RNase-free，可以直接使用，再次處理容易造成二次污染，得不償失。但原則上國(guó)產(chǎn)塑料制品處理后方可使用。處理方法如下： 

　　（1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC有致癌之嫌，須在通風(fēng)柜中小心操作。 

　　（2）將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 

　　（3）在通風(fēng)柜中37℃或室溫下處理過(guò)個(gè)夜。 

　　（4）將EDPC水溶液小心倒入廢液瓶中，用鋁箔封住含DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。上述處理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。 

　　（5）用合適的溫度（80-90℃）烘烤至干燥，置于干凈處備用。 

　　2．玻璃和金屬制品：實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃和金屬器皿經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤8小時(shí)或250℃烘烤3小時(shí)以上。另一種方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。 

　　3．電泳槽：用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1%DEPC處理過(guò)的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿，塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記，存放在指定地點(diǎn)，為RNA實(shí)驗(yàn)專用。 

　　4．移液器：RNase的又一污染源是移液器。根據(jù)移液器制造商的要求對(duì)移液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。移液器金屬退頭器是RNA酶的一個(gè)重要來(lái)源，實(shí)驗(yàn)前最好取下它。 

　　5．溶液：用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無(wú)RNA酶的玻璃器皿�？赡艿脑捜芤簯�(yīng)用0.1% DEPC水于37℃至少處理12小時(shí)，然后于100℃加熱15分鐘或在15 lbf/in2(1.034×105Pa)的高壓下蒸氣滅菌30分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此不能用來(lái)處理含有Tris一類的緩沖液，可存幾瓶新的，未開封的Tris晶體以制備無(wú)RNA酶的溶液。 

　　6．研究人員：RNA酶廣泛存在于人的皮膚上，最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準(zhǔn)備分離和分析RNA的材料和溶液時(shí)，以及在涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套，接觸“臟的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。